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古方荆防败毒散物质基准质量标准研究孟珈同李军鸽王永春邱智东唐秋竹长春中医药大学创新实践中心

摘要：目的建立古代名方荆防败毒散物质基准的质量控制标准。方法薄层色谱法对独活、柴胡定性鉴别;高效液相色谱法对升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷定量分析。结果独活、柴胡薄层色谱斑点清晰,阴性无干扰。升麻素苷在0.～0.μg范围内线性关系良好,5-O-甲基维斯阿米醇苷在0.～0.μg范围内线性关系良好,二者总加样回收率为96.57%,RSD为1.95%（n=6）。每1g荆防败毒散物质基准中升麻素苷和5-0-甲基维斯阿米醇苷的总量不得少于0.47mg。结论本研究制定的荆防败毒散物质基准定性与定量分析方法准确可行,专属性与重复性良好,可有效控制物质基准质量。

荆防败毒散为明代张时彻所著的《摄生众妙方》中记载，处方组成为防风、独活、荆芥、羌活、柴胡、枳壳、前胡、茯苓、桔梗、川芎、甘草共11味药[1]，有发散风寒，解表祛湿的作用，亦可用于痢疾、疮肿初起而有表寒症者[2]。在本次新冠肺炎疫情中，由于荆防败毒散有预防和早期治疗的作用，因此被列入治疗新冠肺炎的推荐药物名单[3]。目前对荆防败毒散的研究方向大多为临床应用或兽类、禽类疫病治疗，对其本身或其制剂的质量控制标准较少。因此本研究将建立古代名方荆防败毒散物质基准的质量标准研究，为后续新剂型开发打下基础。01仪器、药材与试剂1.1仪器LC-型高效液相色谱仪（日本岛津）；TechmateC18色谱柱（4.6mm×mm,5μm）；真空冷冻干燥机（Epsilon);XSE-DU十万分之一电子天平（梅特勒）；ZFS型手提式紫外分析仪（上海嘉鹏科技有限公司）；硅胶G板（青岛海洋）。1.2药材与试剂实验中所用饮片防风、独活、荆芥、羌活、柴胡、枳壳、前胡、茯苓、桔梗、川芎、甘草均由吉林省北药药材加工有限公司提供，以上药材饮片经长春中医药大学翁丽丽教授鉴定及检验均合格；升麻素苷对照品（纯度：94.6%，批号-）、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品（纯度：97.4%，批号-)、独活对照药材（批号-）、柴胡对照药材（批号-）以上均购自中国食品药品检定研究院。乙腈和磷酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。02荆防败毒散物质基准制备荆防败毒散原文为“治疮肿初起，羌活、独活、柴胡、前胡、枳壳、茯苓、防风、荆芥、桔梗、川芎各一钱五分，甘草五分，上用水一钟半，煎至八分，温服。”经考证，明代的1钱约合现代的3.73g，五分约合现代的1.87g，明代1钟约合现代的ml[4]。即取防风、独活、荆芥、羌活、柴胡、枳壳、前胡、茯苓、桔梗、川芎各5.60g，甘草1.87g，加水mL，煎煮约20min，过滤后得煎煮液约mL，浓缩后冷冻干燥，即得。03薄层鉴别3.1独活3.1.1供试品溶液制备取荆防败毒散物质基准2.5g，加乙醚50mL，超声15min，滤过，蒸干后加1mL乙酸乙酯溶解点样。3.1.2对照药材溶液制备取独活对照药材1g，按“3.1.1”方法制备。3.1.3阴性对照溶液制备取荆防败毒散独活阴性冻干粉2.5g，按“3.1.1”方法制备。取供试品溶液10μL、阴性对照溶液10μL，对照药材溶液2μL，以石油醚（30～60℃）-乙醚（3∶2）为展开剂展开，在nm紫外光灯下观察[5]。结果显示，供试品在与对照药材色谱相同位置上显相同颜色的荧光斑点，且阴性对照无干扰。结果见图1。图1独活薄层鉴别1、2供试品；3、4阴性对照；5、6对照药材3.2柴胡3.2.1供试品溶液制备取荆防败毒散物质基准2.5g，加30mL甲醇超声20min，过滤，蒸干滤液，加水20mL溶解残渣，用40mL水饱和的正丁醇提取，用20mL氨试液和10mL氨试液分别洗涤2次，弃去洗液，再用40mL正丁醇饱和的水洗涤，弃去洗液，将正丁醇液蒸干，加2mL甲醇溶解点样[6]。3.2.2对照药材溶液制备取柴胡对照药材lg，加水75mL，煎煮30min，共2次。合并煎煮液，过滤，将滤液蒸干，加5mL甲醇溶解点样。3.2.3阴性对照溶液制备取荆防败毒散柴胡阴性冻干粉2.5g，按“3.2.1”方法制备。吸取上述三种溶液各10μL，乙酸乙酯-乙醇-水（10∶2∶1）为展开剂，展开后晾干，喷2%对二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，在℃下加热至斑点显色清晰，于nm紫外光下观察[7]。结果显示，供试品色谱与对照药材色谱在相同位置显相同颜色荧光斑点，且阴性对照无干扰。结果见图2。图2柴胡薄层鉴别1、2供试品溶液；3、4阴性对照；5、6对照药材04含量测定4.1色谱条件TechmateC18色谱柱（4.6mm×mm,5μm）；流动相乙腈（A)-0.05%磷酸水（B）；梯度洗脱（0-30min,12%A;31-35min,12%-15%A;36-70min,15%A）；波长nm，柱温40℃，进样量10μL；理论板数按升麻素苷峰计算应不低于。4.2对照品溶液制备精密称定升麻素苷对照品与5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量，加甲醇制成每1mL各含60μg的溶液。4.3供试品溶液制备精密称定荆防败毒散物质基准2.5g，精密加入甲醇50mL，称定重量，回流2h，放冷，用甲醇补足减失重量，摇匀后过滤，即得。4.4阴性对照液制备精密称定荆防败毒散防风阴性冻干粉2.5g，按“4.3”项下方法制备。4.5专属性试验按“4.1”项下色谱条件，对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10μL进样，测定。结果见图3。结果显示，供试品色谱与对照品色谱在相同保留时间出现色谱峰，且分离度符合要求，阴性对照无干扰。结果表明，该方法专属性良好。图3专属性高效液相色谱图A升麻素苷对照品；B5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品；C供试品；D阴性对照4.6线性范围考察用甲醇分别配制浓度为0.0、0.、0.、0.、0.0mg/mL的升麻素苷对照品溶液和浓度为0.0、0.、0.、0.、0.0mg/mL的5-O-甲基维斯阿米醇苷溶液。按照“4.1”项下色谱条件进行测定，以进样量为横坐标（X），峰面积（Y）为纵坐标考察线性关系。升麻素苷回归方程为：Y=x+r=0.，表明升麻素苷0.～0.μg范围内呈良好的线性关系。5-O-甲基维斯阿米醇苷回归方程为：Y=x+r=0.，表明5-O-甲基维斯阿米醇苷在0.～0.μg范围内呈良好的线性关系。4.7精密度取“4.3”项下供试品溶液，按“4.1”色谱条件连续进样6次，每次10μL，记录色谱峰面积。升麻素苷RSD为0.39%,5-O-甲基维斯阿米醇苷RSD为0.45%。结果表明，仪器精密度良好。4.8重复性试验取同一荆防败毒散物质基准6份，按“4.3”项下方法制备，以“4.1”项下色谱条件测定。升麻素苷平均含量为0.mg/g,RSD为0.82%,5-O-甲基维斯阿米醇苷平均含量为0.mg/g,RSD为0.92%，结果表明，本方法重复性良好。4.9稳定性试验取“4.3”项下供试品溶液，分别于0、4、8、12、16、24h进样10μL，测定峰面积。升麻素苷RSD为0.34%,5-O-甲基维斯阿米醇苷RSD为0.67%，结果表明，供试品溶液在24h内稳定。4.10准确度精密称定已知升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷浓度的物质基准6份，每份1.0g，分别加入浓度为0.mg/mL的升麻素苷对照品和浓度为0.mg/mL的5-O-甲基维斯阿米醇苷的混合对照品溶液50mL，按“4.3”项下方法制备，测定峰面积。计算得升麻素苷与5-O-甲基维斯阿米醇苷总回收率为96.57%,RSD为1.95%，结果表明，该方法准确度良好。结果见表1。表1准确度试验结果

4.11物质基准含量测定

取5批荆防败毒散物质基准，按照“4.3”项下方法制备，进样量10μL。5批物质基准平均转移率为22.66%,年版《中国药典》防风药材升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的总量不得少于0.24%，按20%转移率计算，每1g荆防败毒散物质基准中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的总量不得少于0.47mg。结果见表2。

表2防风药材升麻素苷与5-O-甲基维斯阿米醇苷总含量测定结果及物质基准转移率05结论

经多批荆防败毒散物质基准验证，本研究建立的薄层色谱方法分离效果好，阴性对照无干扰；含量测定方法专属性强，具有良好的重复性、稳定性，准确度良好，含量测定结果准确可靠。独活和柴胡的薄层色谱鉴别与升麻素苷和5-0-甲基维斯阿米醇苷总量的含量测定能有效控制荆防败毒散物质基准质量，为荆防败毒散后续新剂型开发打下基础。

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